恩施市酸豇豆中乳酸菌多样性解析及其分离株发酵特性评价（一） 境内森林覆盖率近70％

泡菜是恩施浸泡于食盐含量为2％～8％的卤水中，依靠蔬菜自身携带乳酸菌厌氧发酵而成的市酸酸菌一类发酵蔬菜制品的总称，目前用于泡菜制作的豇豆蔬菜主要包括萝卜、辣椒、中乳白菜、多样青菜和豇豆等，性解析及其中酸豇豆因营养成分齐全、其分口感脆爽且风味独特而成为我国泡菜的离株重要组成部分。在泡菜发酵过程中，发酵卤水中微生物群系的特性变化直接决定了泡菜风味品质的形成，因而国内外众多学者对泡菜中微生物的恩施多样性开展了相对系统的研究，多数研究均证实Leuconostocmesenteroides，市酸酸菌(肠膜明串珠菌)、豇豆Leuconostocmesentoroides(植物乳杆菌)和pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)为泡菜中的中乳优势乳酸菌。

近年来随着健康意识的多样提升，消费者越来越倾向于低盐豇豆泡菜，而自然发酵的酸豇豆是最易发生软腐、产生酸败味和“生花”的泡菜之一。较之自然发酵，乳酸菌纯种发酵的豇豆质地变化快且成熟周期短，同时风味较纯正，因而在对酸豇豆中乳酸菌进行分离鉴定的基础上，积极开展具有优良发酵特性乳酸菌菌株的筛选，进而推动酸豇豆发酵模式的改变具有积极的意义。作为华中地区重要的“动植物基因库”，恩施土家族苗族自治州位于鄂、湘和渝三省(市)交汇处，境内森林覆盖率近70％，居住着汉族、土家族、苗族和侗族等众多少数民族。恩施土家族苗族自治州恩施市居民历来有制作和食用酸豇豆的习俗，因而该地酸豇豆中亦可能蕴含着丰富的乳酸菌资源。

本研究对采集自恩施市酸豇豆中乳酸菌的多样性进行了解析，在对其蕴含的乳酸菌资源进行分离鉴定和保藏的基础上，使用电子鼻和电子舌技术对L.plantarum胁埘加纯种发酵酸豇豆的品质进行了评价，以期为后续具有优良酸豇豆发酵特性乳酸菌的筛选提供菌株支持。

一、材料与方法

1、材料与试剂

酸豇豆采集自恩施土家苗族自治州恩施市舞阳坝菜市场和土桥坝菜市场；MRS培养基，青岛海博生物技术有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB)、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、碳酸钙、十二烷基硫酸钠、甘油、过氧化氢、氯仿、饱和酚和异戊醇，国药集团化学试剂有限公司；10×PCRBuffer、rTaq酶和dNTPmix，北京全式金生物技术有限公司；正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1495R(5’-CTACGGCTACCTrGTTACGA-3’)，由武汉天一辉远有限公司合成；AxygenPcR清洁试剂盒，康宁生命科学吴江有限公司。

2、仪器与设备

DG250厌氧工作站，英国DWS公司；ECLIPSECi生物显微镜，日本Nikon公司；ND-2000C微量紫外分光光度计，美国NanoDrop公司；DYY-12电泳仪，北京六一仪器厂；UVPcDs8000凝胶成像分析系统，美国Proteinsimple公司；vetiri梯度基因扩增仪，美国AB公司；5810R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HwS24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；SA402B味觉分析系统，日本INSENT公司；PEN3型电子鼻，德国Airsense公司；BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；PGJ-10-AS纯水仪，武汉品冠仪器设备有限公司。

3、检测与分析方法

（1）酸豇豆中潜在乳酸菌菌株的分离

采用倍比稀释的方法对酸豇豆样品中的菌群进行稀释，选取合适浓度的稀释液涂布于含有1.0％碳酸钙的MRS固体培养基中，在氮气、氢气和二氧化碳体积比为85:10:5的厌氧工作站中37℃培养48h。选取形态大小不同且有透明圈的单菌落进行分离并进行3代纯化，最终将过氧化氢酶实验为阴性且革兰氏染色为阳性的菌株定义为潜在乳酸菌菌株，并使用甘油保藏后置于-80℃冰箱备用。

（2）酸豇豆中潜在乳酸菌菌株的鉴定

将潜在乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后3000r/min离心10min收集菌体，使用CTAB法进行基因组DNA提取，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL无菌水。PCR扩增条件为：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min。PCR扩增结束后使用1.0％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的扩增效果进行检测，上样量为2.5μL。同时使用清洁试剂盒将扩增产物清洁后，进行克隆鉴定，并选取阳性克隆送往武汉天一辉远有限公司进行测序，反馈回的序列经拼接后在NCBI数据库进行比对，依据序列同源性选取与相似度≥99％的模式菌株确定种属关系，并使用MEGA7.O软件进行系统发育树的构建。

（3）L.plantarum纯种发酵酸豇豆的制作

将豇豆洗净沥干后切成长约5cm的小段放入2L玻璃泡菜坛中，同时按照每250g豇豆添加35.5g食盐和600mL纯净水的比例进行酸豇豆的制备。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入将潜在乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后3000r/min离心10min收集菌体，使用CTAB法进行基因组DNA提取，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL无菌水。PCR扩增条件为：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min。PCR扩增结束后使用1.0％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的扩增效果进行检测，上样量为2.5μL。搅拌均匀后泡菜坛口水封，置培养箱中中30℃发酵7d。同时以未接入乳酸菌的酸豇豆作为对照组，且将其定义为自然发酵组。

（4）L.plantarum纯种发酵酸豇豆品质的评价

将豇豆洗净沥干后切成长约5cm的小段放入2L玻璃泡菜坛中，同时按照每250g豇豆添加35.5g食盐和600mL纯净水的比例进行酸豇豆的制备。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入将潜在乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后3000r/min离心10min收集菌体，使用CTAB法进行基因组DNA提取，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL无菌水。PCR扩增条件为：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min。PCR扩增结束后使用1.0％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的扩增效果进行检测，上样量为2.5μL。搅拌均匀后泡菜坛口水封，置培养箱中中30℃发酵7d。发酵好的酸豇豆浆水300r/min离心10min取上清，使用SA402B电子舌参照王玉荣的方法进行酸、苦、涩、咸和鲜5个基本味及后味-A、后味-B和丰度3个回味指标相对强度的测定，进而评价L.plantarum纯种发酵对酸豇豆滋味品质的影响。

亦取豇豆洗净沥干后切成长约5cm的小段放入2L玻璃泡菜坛中，同时按照每250g豇豆添加35.5g食盐和600mL纯净水的比例进行酸豇豆的制备。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入将潜在乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h后3000r/min离心10min收集菌体，使用CTAB法进行基因组DNA提取，并以DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL无菌水。PCR扩增条件为：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10min。PCR扩增结束后使用1.0％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的扩增效果进行检测，上样量为2.5μL。搅拌均匀后泡菜坛口水封，置培养箱中中30℃发酵7d。发酵好的酸豇豆浆水直接装入15mL样品瓶中，55℃水浴10min后室温平衡20min，参照杨成聪的方法使用PEN3电子鼻10组金属氧化物传感器对各敏感物质的响应值进行检测，进而评价L.plantarum纯种发酵对酸豇豆风味品质的影响。

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